中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所張大偉研究員帶領(lǐng)的蛋白合成細(xì)胞工廠與微生物代謝研究團(tuán)隊(duì)近日在維生素B12生物合成技術(shù)開(kāi)發(fā)方面取得新進(jìn)展。該研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)將微生物B12合成途徑中24步催化反應(yīng)進(jìn)行模塊劃分,構(gòu)建了體外無(wú)細(xì)胞催化合成維生素B12的技術(shù)體系,并實(shí)現(xiàn)了體外多酶催化體系中產(chǎn)量的較大提升。
維生素B12是自然界中天然合成的最復(fù)雜的小分子化合物之一,也是高等動(dòng)植物生理活動(dòng)必需的化合物,它以輔酶形式在DNA合成、甲基化和線粒體代謝中發(fā)揮著重要作用。目前,維生素B12的工業(yè)生產(chǎn)主要依賴微生物發(fā)酵來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而,以微生物為底盤合成維生素B12的方法存在菌種改造困難、發(fā)酵周期長(zhǎng)、產(chǎn)物生產(chǎn)和菌株生長(zhǎng)難以實(shí)現(xiàn)平衡等問(wèn)題。
在該研究中,為解決各個(gè)模塊的組裝和優(yōu)化過(guò)程存在的副產(chǎn)物反饋抑制現(xiàn)象,研究團(tuán)隊(duì)在中間產(chǎn)物氫咕啉酸(HBA)合成時(shí)引入S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成反應(yīng)和副產(chǎn)物S-腺苷高半胱氨酸(SAH)分解反應(yīng),有效緩解了反應(yīng)過(guò)程中的副產(chǎn)物反饋抑制現(xiàn)象;為解決腺苷鈷啉胺酸(AdoCby)合成模塊的中間產(chǎn)物檢測(cè)難問(wèn)題,研究團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用“停流檢測(cè)法”,對(duì)模塊中輔因子及副產(chǎn)物進(jìn)行追蹤,實(shí)現(xiàn)了模塊反應(yīng)的檢測(cè)。此外,還通過(guò)構(gòu)建AdoCby及相關(guān)中間產(chǎn)物的直接檢測(cè)方法,實(shí)現(xiàn)了模塊產(chǎn)物的直接檢測(cè);通過(guò)分析級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)間的相互影響,研究人員發(fā)現(xiàn)了反應(yīng)途徑中ATP使用的競(jìng)爭(zhēng)現(xiàn)象,并通過(guò)引入ATP再生反應(yīng)對(duì)該現(xiàn)象進(jìn)行了緩解;針對(duì)維生素B12合成途徑中輔因子種類多、數(shù)量多的特點(diǎn),構(gòu)建了全局輔因子再生系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了體系中輔因子的部分回補(bǔ),對(duì)催化體系進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化與提升。最終,通過(guò)組裝36個(gè)酶的體外多酶催化系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了以5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)為底物合成維生素B12的體系構(gòu)建,及以HBA為底物合成維生素B12的催化體系的產(chǎn)量提升。
業(yè)內(nèi)人士認(rèn)為,該研究不僅開(kāi)拓了除化學(xué)合成法、微生物合成法之外的第三種維生素B12合成方法,同時(shí)也對(duì)維生素B12合成途徑的解析發(fā)揮了積極的推動(dòng)作用,對(duì)構(gòu)建長(zhǎng)途徑、多元素的復(fù)雜無(wú)細(xì)胞合成體系具有一定的指導(dǎo)意義。
轉(zhuǎn)自:中國(guó)食品報(bào)
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