“白藜蘆醇的合成生物學制造技術(shù)”項目通過科技成果鑒定

　　日前，中國輕工業(yè)聯(lián)合會在湖南省津市市組織召開了“白藜蘆醇的合成生物學制造技術(shù)”科技成果鑒定會。該項目由江南大學未來食品科學中心陳堅院士團隊和湖南鴻健生物科技有限公司共同完成。鑒定委員會專家聽取了項目研究工作和技術(shù)報告，并審閱了相關(guān)鑒定資料，經(jīng)質(zhì)詢與討論后一致認為，“白藜蘆醇的合成生物學制造技術(shù)”項目總體技術(shù)達到國際領(lǐng)先水平，研究成果將對應(yīng)用合成生物技術(shù)生產(chǎn)天然產(chǎn)物起到積極的推動作用。

　　白藜蘆醇是一種芪類多酚化合物，具有清除自由基、抗氧化、保護心血管等生理活性，在醫(yī)藥、功能食品、化妝品等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。目前，白藜蘆醇主要采用植物提取的方法制得，對自然植物資源依賴嚴重，而且受提取效率低等因素制約，成本較高、來源受限，無法滿足日益增長的市場需求。隨著合成生物技術(shù)的不斷發(fā)展，在白藜蘆醇等芪類化合物生物合成途徑得到精確解析的基礎(chǔ)上，利用微生物高效異源合成芪類化合物被寄予厚望。之前，國內(nèi)外已有多個團隊開展了天然酶挖掘、途徑組裝、代謝調(diào)控與發(fā)酵優(yōu)化等方面的研究，但是產(chǎn)量一直較低，難以滿足產(chǎn)業(yè)應(yīng)用。

　　從目前來看，白藜蘆醇主要還是從植物虎杖中提取。受環(huán)境因素影響，植物提取的產(chǎn)率低，無法滿足全球的市場需求。根據(jù)Future Market Insights相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，白藜蘆醇的市場規(guī)模約為9770萬美元，預計從2023年到2030年將以8%—10%的復合年增長率增長。

　　雖然白藜蘆醇擁有如此龐大的市場，但因植物提取率低、化學合成效率低以及微生物合成產(chǎn)量低等原因，使其無法滿足市場要求，導致白藜蘆醇的價格一直居高不下。以白藜蘆醇在化妝品工業(yè)中的應(yīng)用為例，盡管白藜蘆醇是一種很有潛力的抗氧化劑，但由于其價格過于高昂，導致其下游終端產(chǎn)品的價格居高不下。

　　如何開辟新途徑，開發(fā)成本更低的白藜蘆醇生產(chǎn)技術(shù)，是解決這一問題的根本出路。為此，陳堅院士團隊在國家重點研發(fā)計劃項目、國家自然科學基金創(chuàng)新研究群體項目、國家自然科學基金優(yōu)秀青年基金等項目的資助下，重點研究和開發(fā)了發(fā)酵法生產(chǎn)白藜蘆醇的關(guān)鍵技術(shù)。

　　項目研究團隊周景文教授在會上向?qū)＜医M匯報研發(fā)工作情況時介紹，在前期研究工作的基礎(chǔ)上，經(jīng)過10年的艱苦工作，研究團隊深入開展了白藜蘆醇合成生物學制造的多項研究工作。

　　一是大腸桿菌中合成白藜蘆醇的合成生物學制造初探。通過基因工程構(gòu)建合成對香豆酸的重組大腸桿菌，建立針對于對香豆酸的高通量篩選模型，結(jié)合定向進化策略，提高了酪氨酸解氨酶的活性，對香豆酸產(chǎn)量提高了20%。通過模塊化組裝白藜蘆醇途徑，平衡丙二酸同化途徑和白藜蘆醇合成途徑，實現(xiàn)了大腸桿菌中白藜蘆醇的從頭合成。這一結(jié)果為在模式微生物中結(jié)合基因工程改造策略和高通量篩選策略提高白藜蘆醇合成效率提供了參考。

　　二是釀酒酵母中合成白藜蘆醇的合成生物學制造。以模式真核生物釀酒酵母為出發(fā)菌株，通過代謝工程改造，增強前體供給，弱化旁路競爭途徑。探究轉(zhuǎn)運蛋白對香豆酸的積累影響，增強前體對香豆酸的積累。平衡糖異生途徑與莽草酸途徑，強化莽草酸途徑相關(guān)基因，增強莽草酸通量，并對酪氨酸解氨酶進行區(qū)室化定位，實現(xiàn)前體對香豆酸的高效積累。最終，通過Ty轉(zhuǎn)座隨機整合4CL和STS相關(guān)基因，實現(xiàn)了白藜蘆醇在釀酒酵母中最高可達88.37毫克/升的產(chǎn)量。這一結(jié)果為白藜蘆醇在真核微生物中生產(chǎn)提供了思路，并展現(xiàn)出真核微生物比原核微生物更具有優(yōu)勢。

　　三是解脂亞洛酵母中代謝重構(gòu)高效合成白藜蘆醇。以非常規(guī)酵母解脂亞洛酵母為出發(fā)菌株，通過對不同白藜蘆醇合成基因的篩選，強化莽草酸途徑，融合表達香豆酰輔酶A連接酶和芪合成酶，協(xié)同表達酪氨酸解氨酶與苯丙氨酸解氨酶途徑增加前體供給，最終將碳代謝流重新分布，實現(xiàn)了對香豆酸和白藜蘆醇的高效積累。這些結(jié)果表明非常規(guī)酵母解脂亞洛酵母是白藜蘆醇生產(chǎn)的優(yōu)良宿主。以強化前體對香豆酸合成的解脂亞洛酵母為出發(fā)菌株，利用多拷貝整合工具整合關(guān)鍵限速步驟基因，結(jié)合強化丙二酰輔酶A的供給，實現(xiàn)了白藜蘆醇的高效合成。

　　四是基于微生物生理特性研究的發(fā)酵過程優(yōu)化。參考已知的生化反應(yīng)計量關(guān)系，以及解脂亞洛酵母的代謝途徑和生理代謝特征，通過發(fā)酵工藝優(yōu)化使解脂亞洛酵母在發(fā)酵過程中處于酵母形態(tài)，實現(xiàn)了白藜蘆醇的高產(chǎn)，為工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

　　五是白藜蘆醇發(fā)酵工業(yè)規(guī)模放大及產(chǎn)品提取。在上述研究基礎(chǔ)上，通過發(fā)酵過程優(yōu)化控制策略，對解脂亞洛酵母高產(chǎn)白藜蘆醇發(fā)酵過程逐級放大過程中的環(huán)境因素控制，成功實現(xiàn)工業(yè)放大發(fā)酵試驗，產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度得到了進一步提升。使用可回收的溶劑提取發(fā)酵液中的白藜蘆醇，并對工藝條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，包括發(fā)酵液預處理、脫色劑篩選、萃取條件優(yōu)化等，成功實現(xiàn)了白藜蘆醇的高效分離和高純度提取。

　　鑒定委員會認為，該項目通過在解脂亞洛酵母中進行合成基因篩選、莽草酸途徑強化、中心碳代謝流重塑、關(guān)鍵基因表達強度優(yōu)化、多拷貝整合工具構(gòu)建、高產(chǎn)菌株高通量篩選等研究，構(gòu)建了高效的白藜蘆醇合成細胞工廠。在30噸發(fā)酵罐規(guī)模白藜蘆醇產(chǎn)量、轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)強度均達到國際水平，并實現(xiàn)了發(fā)酵法生產(chǎn)白藜蘆醇的分離與高純度提取。

　　專家指出，該項目對于實現(xiàn)用發(fā)酵法工業(yè)化生產(chǎn)白藜蘆醇，打破國外公司對合成生物技術(shù)生產(chǎn)白藜蘆醇的壟斷，全面提升白藜蘆醇發(fā)酵工業(yè)的技術(shù)水平，具有十分重要的現(xiàn)實意義，建議進一步加快項目技術(shù)的推廣應(yīng)用。（記者 王 薇）

　　轉(zhuǎn)自：中國食品報

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