下呼吸道感染病原學(xué)分子診斷技術(shù)進(jìn)展

下呼吸道感染是一種常見(jiàn)的感染性疾病，嚴(yán)重危害人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)，2008年全球下呼吸道感染的病死率為6.1%，居人類十大死因的第3位。下呼吸道感染的常見(jiàn)病原體包括細(xì)菌、病毒、支原體、衣原體及寄生蟲(chóng)等。研究結(jié)果顯示，對(duì)病原體準(zhǔn)確可靠的診斷是有效控制下呼吸道感染、提高治愈率和降低細(xì)菌耐藥性的重要保證。但目前臨床常規(guī)采用的細(xì)菌培養(yǎng)、病毒分離等病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)普遍存在著耗時(shí)長(zhǎng)、敏感度差等不足，大大降低了檢測(cè)效率，難以對(duì)臨床抗感染治療發(fā)揮有效的指導(dǎo)作用。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，病原學(xué)診斷與分子生物學(xué)技術(shù)密切結(jié)合，形成了病原學(xué)分子診斷技術(shù)。這一新興技術(shù)的崛起，徹底打破了傳統(tǒng)的主要靠培養(yǎng)檢測(cè)的局限性，并憑借其快速、準(zhǔn)確、敏感及特異等優(yōu)勢(shì)在病原學(xué)診斷方面凸顯作用，為下呼吸道感染的診斷、治療及新型病原體的檢出和細(xì)菌耐藥機(jī)制的研究等方面提供可靠的技術(shù)支持。現(xiàn)將下呼吸道感染的病原學(xué)分子診斷技術(shù)的進(jìn)展綜述如下。

一、核酸檢測(cè)

分子生物技術(shù)最早用于病原學(xué)診斷是從核酸檢測(cè)開(kāi)始。核酸檢測(cè)技術(shù)發(fā)展至今，大致經(jīng)歷了核酸雜交、分離、擴(kuò)增及基因芯片、PCR、DNA圖譜分析及DNA測(cè)序等技術(shù)。

1．核酸雜交：最早出現(xiàn)的核酸雜交技術(shù)是利用生物素、放射性同位素、酶等標(biāo)記的探針與樣品的核酸片段進(jìn)行雜交，通過(guò)檢測(cè)特異的雜交信號(hào)確定病原體。該技術(shù)的特點(diǎn)是特異度和敏感度均高，幾乎接近100%，特別是后續(xù)發(fā)展的熒光原位雜交 FISH技術(shù)，在病原學(xué)分子診斷的早期起到了至關(guān)重要的作用。核酸雜交技術(shù)的關(guān)鍵在于探針的設(shè)計(jì)，目前，軍團(tuán)菌探針、肺炎支原體探針、EB病毒探針、呼吸道合胞病毒探針及肺孢子菌探針等已陸續(xù)問(wèn)世，使下呼吸道感染的典型和非典型病原體的診斷成為可能。Edelstein等制備的cDNA探針具有軍團(tuán)菌屬的特異性，經(jīng)美國(guó)基因探針公司改進(jìn)后，成為商用探針試劑盒，已被臨床實(shí)驗(yàn)室采用。Hyman等制備的DNA探針可檢出含量?jī)H為0.1 ng的肺炎支原體DNA。Hernandez等采用核酸雜交技術(shù)成功檢測(cè)到呼吸道合胞病毒。核酸雜交技術(shù)是其他核酸檢測(cè)的基礎(chǔ)，為病原學(xué)分子診斷的開(kāi)展邁出了重要的一步。

2．聚合酶鏈反應(yīng)PCR：自20世紀(jì)80年代問(wèn)世以來(lái)，PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，具有劃時(shí)代的意義。從最早的標(biāo)準(zhǔn)PCR，逐漸發(fā)展到多重PCR multiplex PCR、巢式PCR nested PCR、反轉(zhuǎn)錄PCR RT-PCR以及實(shí)時(shí)定量PCR real-time quantitative PCR等，目前PCR技術(shù)已有十幾種，其擴(kuò)增能力和精確性逐步提高。標(biāo)準(zhǔn)PCR主要是針對(duì)某單一基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，多重PCR可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)基因片段，而巢式PCR以及目前廣泛應(yīng)用的實(shí)時(shí)定量PCR在檢測(cè)準(zhǔn)確性方面則更具優(yōu)勢(shì)。

眾所周知，對(duì)于肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等苛養(yǎng)菌以及嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎支原體等非典型病原體來(lái)說(shuō)，臨床分離、培養(yǎng)難度很大，大大降低了臨床檢出率，而PCR技術(shù)可以彌補(bǔ)這一缺陷。Morozumi等采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，從429例成人和兒童肺炎臨床標(biāo)本中檢測(cè)到肺炎鏈球菌的lytA基因、軍團(tuán)菌的mip基因以及肺炎支原體的16S rRNA，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅耗時(shí)2h，且與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)方法相比，敏感度和特異度均大大提高。除了上述病原體外，Kawazu等還應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)在呼吸道分泌物中檢測(cè)到了曲霉，突破了曲霉培養(yǎng)的種種限制。不僅針對(duì)細(xì)菌，PCR技術(shù)在病毒診斷方面也毫不遜色。Beckham等利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法對(duì)194例合并呼吸道病毒感染的COPD患者的咽拭子樣本進(jìn)行了病毒檢測(cè)并與常規(guī)分離和血清學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCR方法的病毒檢出率為41. 8%，而常規(guī)方法的檢出率僅為23.4%，這一結(jié)果對(duì)于COPD急性發(fā)作患者的病原學(xué)快速診斷頗具意義，還可以指導(dǎo)用藥，縮短患者住院時(shí)間。

國(guó)內(nèi)對(duì)于病原體PCR診斷的研究也十分迅猛，方健等利用PCR技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)15種呼吸道病原體。2003年SARS暴發(fā)期間，研究者正是采用了實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)和DNA測(cè)序技術(shù)才能在短短3個(gè)月內(nèi)將SARS的元兇鎖定為新型冠狀病毒。2009年，我國(guó)發(fā)現(xiàn)的新型布尼亞病毒也是應(yīng)用了此項(xiàng)技術(shù)。

另外，PCR技術(shù)在檢測(cè)細(xì)菌耐藥方面也發(fā)揮了重要作用。研究結(jié)果表明，與細(xì)菌耐藥相關(guān)的因子如新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶1（NDM-1）、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶ESBL、青霉素結(jié)合蛋白2a PBP2a、外膜孔蛋白OprD等都有對(duì)應(yīng)的基因片段，因而可以通過(guò)設(shè)計(jì)不同的引物來(lái)檢測(cè)這些基因。Diene等采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)了128株菌株中NDM-1基因，顯示了該技術(shù)對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥機(jī)制研究的快速、敏感等優(yōu)勢(shì)。管希周等利用多重PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)了同時(shí)產(chǎn)AmpC β-內(nèi)酰胺酶AmpC和ESBL的肺炎克雷伯桿菌及其耐藥表型。應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行耐藥研究，避免了細(xì)菌分離、培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)等繁瑣的操作步驟。近年來(lái)，隨著多種PCR方法聯(lián)合應(yīng)用以及大量商品化試劑盒的出現(xiàn)，該技術(shù)正日益走向成熟。

3．DNA圖譜分析：除了核酸雜交、PCR等針對(duì)病原體某一特定核酸片段進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)外，還有針對(duì)病原體全基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。目前常用的技術(shù)包括質(zhì)粒DNA圖譜分型、染色體DNA限制性內(nèi)切酶分析以及DNA脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型3種技術(shù)。這些技術(shù)通過(guò)采用凝膠電泳、圖譜分析等方法檢測(cè)病原體全基因組DNA，從而為病原體檢測(cè)和分型提供了新的手段。目前，質(zhì)粒DNA圖譜以及DNA脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型技術(shù)已應(yīng)用于葡萄球菌的分型和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 MRSA耐藥機(jī)制的研究。質(zhì)粒圖譜分型可適用于一切有質(zhì)粒的病原體；DNA脈沖場(chǎng)凝膠電泳常作為分子生物學(xué)分型方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但以上這些技術(shù)也存在著DNA圖譜分析較復(fù)雜、分辨力較低及再現(xiàn)性較差等缺點(diǎn)。

4．DNA測(cè)序：對(duì)于病原體核酸不僅要了解其整體結(jié)構(gòu)、片段組成，還要了解DNA堿基種類、數(shù)目以及排列等，這就需要應(yīng)用DNA測(cè)序技術(shù)。1977年Sanger和Maxam分別利用雙脫氧鏈終止法和化學(xué)降解法測(cè)定了DNA序列，此后DNA測(cè)序技術(shù)開(kāi)始應(yīng)用于生物、醫(yī)學(xué)、法醫(yī)及藥學(xué)等領(lǐng)域。早在1985年，英國(guó)Lambden即利用該技術(shù)測(cè)定了呼吸道合胞病毒磷酸化蛋白編碼的核苷酸序列，近年來(lái)，這一技術(shù)已經(jīng)用于真菌、細(xì)菌、結(jié)核桿菌及弓形蟲(chóng)等病原體的檢測(cè)，尤其在結(jié)核桿菌檢測(cè)方面與核酸雜交技術(shù)相比費(fèi)用明顯降低。但由于測(cè)序技術(shù)對(duì)序列要求較高，因而只能檢測(cè)到細(xì)菌潛在變化序列的很小一部分，因此目前該技術(shù)主要應(yīng)用于病毒檢測(cè)，如2007年我國(guó)溫嶺第一人民醫(yī)院發(fā)現(xiàn)了導(dǎo)致小兒下呼吸道感染的新型病毒-Wu多瘤病毒亞洲種，并完成了測(cè)序工作。但由于DNA測(cè)序技術(shù)條件嚴(yán)格、儀器復(fù)雜及費(fèi)用昂貴等原因，目前一般臨床實(shí)驗(yàn)室尚無(wú)法進(jìn)行，主要用于科學(xué)研究。

二、蛋白質(zhì)檢測(cè)

對(duì)于生物體而言，核酸和蛋白質(zhì)是決定其生物學(xué)特性的重要物質(zhì)，核酸是生物的遺傳物質(zhì)，而蛋白質(zhì)則是生命活動(dòng)的體現(xiàn)者。因此，對(duì)病原體的檢測(cè)，除了針對(duì)核酸以外，還要研究其蛋白功能。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，基因組學(xué)的研究重點(diǎn)也轉(zhuǎn)移到了蛋白功能的研究，而后基因時(shí)代應(yīng)運(yùn)而生的蛋白質(zhì)組學(xué)，也為呼吸道病原體的研究提供了一個(gè)新的平臺(tái)。針對(duì)病原體蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測(cè)技術(shù)主要是二維電泳和質(zhì)譜或色譜分析，即將病原體的蛋白通過(guò)二維電泳轉(zhuǎn)移到膠上，再經(jīng)圖像分析，選取特定的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，經(jīng)酶解和后續(xù)的質(zhì)譜或色譜分析以及數(shù)據(jù)處理，確定病原體的屬性，目前該技術(shù)主要用于細(xì)菌鑒定和耐藥機(jī)制方面的研究。國(guó)外學(xué)者曾報(bào)道用蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)了MRSA和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌 MSSA的蛋白質(zhì)組學(xué)，并分析比較了兩者的差異，從而證實(shí)了蛋白質(zhì)組學(xué)在病原診斷方面的作用。另外，Schaar等利用二維電泳和質(zhì)譜分析方法發(fā)現(xiàn)，卡他莫拉菌的外膜囊泡具有很高的生物學(xué)活性，是運(yùn)輸細(xì)菌致病因子的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)；Soualhine等發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌突變株的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白與細(xì)菌耐藥有關(guān)。

三、生物芯片技術(shù)

近年來(lái)，生物芯片技術(shù)得到了迅猛發(fā)展，為病原體的檢測(cè)提供了新的技術(shù)平臺(tái)。目前用于病原體檢測(cè)的生物芯片主要包括基因芯片、蛋白芯片以及微流控芯片實(shí)驗(yàn)室等，這些技術(shù)憑借其微型化、高通量及自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)，在微生物病原體檢測(cè)、種類鑒定、功能分析診斷、基因分型、突變篩查以及基因組監(jiān)測(cè)等方面正在發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。

基因芯片是最早用于病原體的分子生物學(xué)芯片。將代表各種病原體的特殊基因信息印制在一張基因芯片上，再經(jīng)反轉(zhuǎn)錄過(guò)程與樣品結(jié)合，即可檢測(cè)出樣本中有無(wú)特異病原體基因及其表達(dá)水平，由此判斷感染的病原體、感染進(jìn)程以及宿主反應(yīng)等。目前，由于許多病原體的基因組測(cè)序工作已經(jīng)完成，基因芯片技術(shù)正在逐漸應(yīng)用于臨床。除了基因芯片外，其他生物學(xué)芯片技術(shù)也日臻成熟，如Causse等利用DNA芯片和多重反轉(zhuǎn)錄PCR方法檢測(cè)了呼吸道合胞病毒；2003年我國(guó)利用自主研制的全基因組芯片成功檢測(cè)出了SARS病毒。同樣，蛋白芯片在病原體分子診斷方面也有著廣闊的發(fā)展空間，以此為平臺(tái)可以檢測(cè)出病原體間蛋白表達(dá)的差異，尤其對(duì)于呼吸道病毒。如楊侃等利用蛋白芯片技術(shù)檢測(cè)了1022例兒童急性呼吸道感染患者的病原體，其病毒陽(yáng)性檢出率與ELISA法無(wú)明顯差異，進(jìn)而也驗(yàn)證了芯片技術(shù)在臨床病原體檢測(cè)方面的高效性和便捷性。

另外一種值得一提的是微流控芯片技術(shù)，也稱芯片實(shí)驗(yàn)室，該技術(shù)具有高通量、高效率、低消耗及集成化等特點(diǎn)，在病原體核酸及蛋白檢測(cè)方面的優(yōu)勢(shì)正日益凸顯。Song等利用該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了細(xì)菌分選，還實(shí)現(xiàn)了計(jì)數(shù)和鑒定；Sun等采用微芯片平臺(tái)對(duì)禽流感病毒的RNA進(jìn)行了快速檢測(cè)。微流控芯片技術(shù)雖然剛起步，但其在分子診斷方面將具有廣闊的應(yīng)用前景。

四、展望

綜上所述，與傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)等檢測(cè)手段相比，分子診斷技術(shù)具有特異、敏感、快速及便捷等優(yōu)勢(shì)，必將在下呼吸道病原學(xué)診斷方面發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。盡管目前這些技術(shù)尚存在假陽(yáng)性、假陰性等不足，且操作復(fù)雜，成本昂貴，甚至有些技術(shù)仍處于起步和基礎(chǔ)研究階段，臨床尚有待推廣。但隨著經(jīng)濟(jì)水平的提高和科技的不斷發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)在臨床中的轉(zhuǎn)化應(yīng)用將逐漸成為臨床病原學(xué)診斷的主要手段。在不久的將來(lái)，借助于分子診斷技術(shù)，通過(guò)一滴血、一滴尿以及其他體液或組織，就可在最短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出病原體，實(shí)現(xiàn)快速、便捷、高效的病原學(xué)分子診斷，為臨床治療提供指導(dǎo)，同時(shí)也將大大降低醫(yī)療費(fèi)用，減輕社會(huì)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

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