高危HPV分型聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢測

　　宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一。每年，全球有將近50萬女性被診斷為宮頸癌，其中有半數(shù)患者發(fā)生在亞洲。在我國，宮頸癌發(fā)病率在女性惡性腫瘤中占第二位，僅次于乳腺癌，每年新發(fā)宮頸癌病例數(shù)約占世界總發(fā)病數(shù)的28%。

　　宮頸癌早期癥狀隱匿，即使宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）已發(fā)展為早期宮頸癌，仍然有半數(shù)以上患者沒有臨床癥狀。因此，憑肉眼觀察無法診斷宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌。而一旦疾病發(fā)展成癌癥并擴(kuò)散至其他器官，每5名女性患者中只有1人能存活5年。盡早篩查，及時(shí)發(fā)現(xiàn)和治療宮頸癌前病變是防治宮頸癌、降低疾病死亡風(fēng)險(xiǎn)的重要手段。

　　在全球，宮頸癌篩查開展了近50年，已大大減少了宮頸癌發(fā)病與死亡率，但宮頸癌篩查仍面臨著費(fèi)用高、醫(yī)療資源不足、以及人群覆蓋率低與隨訪率低的三大“瓶頸”問題。因此，宮頸癌篩查迫切需要兼具高敏感、高通量且易于大規(guī)模實(shí)施的篩查方案。“高風(fēng)險(xiǎn)HPV分型聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢測”的宮頸癌篩查模式不僅能保持HPV篩查高敏感性的優(yōu)勢，有效提高特異性，還大大減少需細(xì)胞學(xué)檢查與陰道鏡回叫率，更為經(jīng)濟(jì)。同時(shí)，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的HPV分型檢測敏感性更高，檢測通量高，重復(fù)性更好，并且一次檢測同時(shí)完成一次篩查（HPV初篩）與二次篩查（篩查陽性者高風(fēng)險(xiǎn)亞型的分流），適用于大樣本人群宮頸癌篩查以及宮頸癌病變臨床診治。這一篩查模式也得到了2013年亞太區(qū)生殖道感染與腫瘤研究組織（AOGIN）年會(huì)各國女性健康專家的認(rèn)可。

　　篩查是關(guān)鍵，技術(shù)手段待突破

　　目前宮頸癌初篩的常用手段是細(xì)胞學(xué)涂片，主要檢查宮頸細(xì)胞的變異情況。自1941 年傳統(tǒng)巴氏涂片被引入臨床作為常規(guī)篩查項(xiàng)目以來，一些國家的宮頸癌發(fā)病及死亡率已大幅下降。但巴氏涂片準(zhǔn)確性受多種因素影響，如： 涂片取材方法、涂片制作、染色技巧、讀片水平等，臨床應(yīng)用中假陰性率及誤診率較高，而且對(duì)患病的風(fēng)險(xiǎn)性無法進(jìn)行預(yù)測。

　　近年來，液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測技術(shù)、細(xì)胞學(xué)自動(dòng)閱片系統(tǒng)和細(xì)胞學(xué)形態(tài)學(xué)描述分類（TBS）的應(yīng)用有效提高了細(xì)胞學(xué)檢測的診斷價(jià)值，但仍然存在受人為因素影響較大及靈敏度低的問題，且這些新技術(shù)在提高篩查效果的同時(shí)也增加了單張涂片成本，在大規(guī)模篩查應(yīng)用上受到限制。

　　高風(fēng)險(xiǎn)HPV基因檢測：宮頸癌篩查新方向

　　以往，宮頸癌篩查是以早期檢出宮頸癌為目的，而隨著宮頸癌病因及病程的明確，現(xiàn)代宮頸癌篩查已將早期檢出高級(jí)別CIN 并進(jìn)行阻斷性治療作為目標(biāo)。

　　近年來，人類乳頭狀瘤病毒（HPV）的發(fā)現(xiàn)及分型為宮頸癌篩查提供了一個(gè)全新途徑。1976 年，Zur Hausen H 首次提出人類乳頭狀瘤病毒（HPV）與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)。隨后大量流行病學(xué)資料及研究已明確顯示HPV 持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)病的首要條件。絕大多數(shù)宮頸癌樣本都可檢出HPV，HPV陰性者幾乎不會(huì)發(fā)生宮頸癌，但并非所有HPV 感染者都會(huì)進(jìn)展為癌。大部分HPV感染僅為一過性感染[雷雨,闞延靜,潘連軍.中國婦幼保健.2012年第33期]，只有HPV持續(xù)感染才可能發(fā)展為CIN和癌癥。此外，不同亞型的致病性及疾病預(yù)后存在差異。研究顯示，有14種HPV病毒株（HPV16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66和68b）是造成宮頸癌及其癌前病變的高風(fēng)險(xiǎn)HPV亞型，其中HPV16和HPV18這兩種病毒株的風(fēng)險(xiǎn)最高，可導(dǎo)致70%－85%的宮頸癌病例，且感染后病毒清除率較低，治療后病灶殘留率和復(fù)發(fā)率較高。

　　宮頸癌發(fā)展過程中存在較長的、可逆轉(zhuǎn)的癌前病變期，如能及時(shí)進(jìn)行HPV檢測，并在癌前病變階段進(jìn)行醫(yī)學(xué)干預(yù)，其治愈率可達(dá)98%。同時(shí)，由于不同HPV亞型的致病性及預(yù)后的差異，如能對(duì)HPV進(jìn)行分型，將有助于有效識(shí)別高危人群。由于宮頸HPV 感染多為隱性亞臨床感染,，且HPV 不能在培養(yǎng)環(huán)境中穩(wěn)定生長，因此，HPV感染只能通過HPV基因檢測或基因表達(dá)的檢測來發(fā)現(xiàn)。

　　近年來，高風(fēng)險(xiǎn)HPV基因檢測以其高靈敏度、快速、客觀的特點(diǎn)，聯(lián)合傳統(tǒng)、經(jīng)濟(jì)的細(xì)胞學(xué)檢測，成為宮頸癌篩查的最佳方案，并得到美國預(yù)防服務(wù)工作組（USPSTF）發(fā)布的2012年新版宮頸癌篩查指南、美國癌癥學(xué)會(huì)（ACS）、美國陰道鏡檢查與宮頸病理學(xué)會(huì)（ASCCP）和美國臨床病理學(xué)會(huì)（ASCP）聯(lián)合發(fā)布的2012年新版宮頸癌篩查指南的推薦。目前，亞太區(qū)各國專家正根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r研究美國相關(guān)指南，從而改善現(xiàn)行宮頸癌篩查制度，希望進(jìn)一步幫助降低國內(nèi)宮頸癌的發(fā)病率和死亡率。

　　HPV基因檢測聯(lián)合細(xì)胞學(xué)方法：宮頸癌篩查和臨床診治的新動(dòng)力

　　和其他宮頸癌篩查方法相比，HPV基因檢測受人為因素影響小，靈敏度高，用于人群篩查漏診率小于5%，陰性預(yù)測值高達(dá)99%，且可預(yù)測患病風(fēng)險(xiǎn)，并可對(duì)被篩查者自助獲取的宮頸陰道脫落細(xì)胞樣本進(jìn)行檢測，但其特異性相對(duì)較低，陽性者多為一過性HPV感染而非癌前病變，導(dǎo)致陰道鏡回叫率和宮頸活檢的比例增加，從而增加了患者的精神壓力及隨診費(fèi)用。因此，有必要探討二次篩查指標(biāo)，對(duì)篩查陽性者進(jìn)一步分流。對(duì)30歲以上的女性采用HPV檢測作為初篩，以HPV高風(fēng)險(xiǎn)亞型（16、18）聯(lián)合細(xì)胞學(xué)為二次篩查，是目前評(píng)價(jià)較好的篩查方案。

　　可分型的HPV為初篩聯(lián)合細(xì)胞學(xué)“序貫二次篩查”的方案見下圖。若HPV初篩為陰性，則篩查結(jié)束，每2－3年進(jìn)行復(fù)查即可；若HPV 16或18亞型陽性，則需要接受陰道鏡下宮頸活檢；若HPV 16或18以外的HPV亞型呈陽性，則要聯(lián)合細(xì)胞學(xué)進(jìn)一步檢查。若細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果為未明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細(xì)胞（ASCUS）及以上級(jí)別病變，則需要接受陰道鏡下宮頸活檢；若細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果為陰性，則每年采用HPV基因檢測聯(lián)合細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行復(fù)查即可。該方法同時(shí)完成HPV初篩與高風(fēng)險(xiǎn)亞型的二次篩查，可在保持HPV篩查高敏感性、高陰性預(yù)測值、高檢測效率優(yōu)勢的前提下，有效提高特異性，大大減少需細(xì)胞學(xué)檢查與陰道鏡回叫率，在宮頸癌大樣本人群篩查中具有顯著優(yōu)勢。通過有效利用HPV基因分型檢測技術(shù)，可有效地分流HPV陽性的高風(fēng)險(xiǎn)人群，并可預(yù)測受檢者患宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)，確定最合適的篩查間隔。

　　HPV高風(fēng)險(xiǎn)亞型（16、18）有提示病變的作用，在臨床診治中同樣具有重要作用。對(duì)于細(xì)胞學(xué)陰性者，如果接受高風(fēng)險(xiǎn)HPV基因檢測，就有可能發(fā)現(xiàn)細(xì)胞學(xué)漏診的宮頸病變患者；對(duì)于細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果為ASCUS者， HPV基因檢測可有效的再分類，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)近期宮頸癌高風(fēng)險(xiǎn)者并進(jìn)行嚴(yán)密隨訪；對(duì)于細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果與宮頸病理診斷均為低度病變的高風(fēng)險(xiǎn)者，HPV基因檢測更成為有效的隨訪指標(biāo)。

　　cobas 4800 HPV DNA檢測：可分型的高靈敏HPV基因檢測

　　目前臨床常用的HPV 基因檢測方法主要基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）或核酸雜交技術(shù)。第二代核酸雜交捕獲法，可同時(shí)檢測13種高危HPV，得到了較廣泛的應(yīng)用，但其無法對(duì)HPV進(jìn)行基因分型鑒定，尤其無法鑒別HPV16和HPV18這兩種患病風(fēng)險(xiǎn)最高的亞型。傳統(tǒng)的PCR檢測方法雖然具備高敏感性，但容易產(chǎn)生樣品交叉污染導(dǎo)致的假陽性，且進(jìn)行基因分型時(shí)操作繁瑣。而新一代以PCR為基礎(chǔ)的HPV DNA分型檢測（例如cobas 4800 HPV DNA檢測）靈敏度高，能夠同時(shí)完成高風(fēng)險(xiǎn)HPV檢測與DNA基因亞型篩查，是目前進(jìn)行HPV基因檢測的較好方法，且其檢測高通量、重復(fù)性好，在大樣本篩查中具有獨(dú)特優(yōu)勢。

　　cobas 4800 HPV DNA檢測采用全自動(dòng)樣品制備與實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增和檢測技術(shù)，集全自動(dòng)樣品制備、PCR擴(kuò)增、基因分型檢測于一體，提供HPV16型、18型和其他12個(gè)高風(fēng)險(xiǎn)HPV亞型（HPV31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,66和68b）匯總的結(jié)果。除檢測HPV病毒之外，也檢測β-球蛋白，作為內(nèi)部質(zhì)控并確定樣本是否含有抑制擴(kuò)增的因素。其樣本制備由x 480全自動(dòng)樣品制備儀自動(dòng)完成，采用的磁珠分離技術(shù)具有高效、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的特點(diǎn)，并可消除潛在的PCR抑制。PCR擴(kuò)增則采用z 480全自動(dòng)實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀。為保證PCR結(jié)果的準(zhǔn)確性，預(yù)防非特異性PCR擴(kuò)增和污染，z480的反應(yīng)體系中加入了AmpErase酶進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，且工作環(huán)境密閉，不需進(jìn)行常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)操作，避免了人為污染。該檢測已獲得美國FDA、歐盟CE認(rèn)證，并于2012年獲得中國SFDA批準(zhǔn)，在宮頸癌篩查及診療領(lǐng)域?qū)碛袕V闊的應(yīng)用前景。

　　結(jié)論

　　1. HPV為初篩方案因其高敏感性，高陰性預(yù)測值、高檢測效率而適于大樣本人群篩查

　　2. HPV高致病亞型16,18有提示病變作用，是有效的二次篩查指標(biāo)

　　3. HPV高致病亞型16,18聯(lián)合細(xì)胞學(xué)“序貫二次篩查”可在保持HPV篩查高敏感性優(yōu)勢的前提下，有效提高特異性，并且大大減少需細(xì)胞學(xué)檢查與回叫率，更符合衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)要求

　　4. 以PCR為基礎(chǔ)的HPV分型檢測用于自取樣本的檢測同樣具有高敏感性，由于同時(shí)完成了HPV初篩（一次篩查）與HPV DNA亞型的二次篩查，及檢測的高通量和重復(fù)性好，在大樣本篩查中具有獨(dú)特優(yōu)勢。

來源：藥品資訊網(wǎng)信息中心

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